핵산 추출은 NGS 샘플 준비 프로토콜의 첫 단계입니다. 핵산은 알려진 모든 생명체에 필수적인 거대 생체 분자입니다. 핵산은 뉴클레오타이드로 구성되는데, 뉴클레오타이드는 당, 인산, 그리고 질소 염기의 세 가지 구성 요소로 이루어진 단량체입니다. 핵산의 두 가지 주요 종류는 DNA와 RNA입니다. RNA의 당은 리보스이고, DNA의 당은 디옥시리보스입니다.
RNA(왼쪽)와 DNA(오른쪽)의 구조를 보여주는 그림. RNA에서는 우라실이 아데닌과 염기쌍을 이루고, DNA에서는 티민이 아데닌과 염기쌍을 이룹니다. 이미지 출처: 위키백과
핵산 추출의 종류
구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출
핵산의 세포 구조가 파괴된 후, DNase와 RNase를 사용하여 세포 핵산 분해효소를 불활성화합니다. 그러면 원하는 핵산을 세포 잔해로부터 분리할 수 있습니다.
페놀 자체는 가연성, 부식성, 독성을 가진 석탄산입니다. 그러나 페놀, 클로로포름, 그리고 소량의 이소아밀의 혼합물을 사용하여 DNA를 추출할 수 있습니다. 페놀과 클로로포름을 시료에 첨가하면 친수성으로 인해 상단에 DNA 층이 포함된 에멀전이 형성됩니다. 그런 다음 원심분리하여 DNA를 채취하고 침전시킵니다. 생성된 DNA 펠릿은 멸균수에 녹입니다.
페놀-클로로포름 추출 단계를 보여주는 다이어그램: 페놀-클로로포름 혼합물을 세포 용해물에 첨가하고 원심분리한 후 물로 세척하여 분리된 DNA를 얻습니다. 이미지 출처: Eva Meszaros, 2021
구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 기술을 사용하면 단일 단계로 RNA를 추출할 수 있습니다. 추출 후, 구아니디늄 티오시아네이트, 아세트산나트륨, 페놀, 클로로포름으로 구성된 산성 용액을 사용하여 DNA에서 RNA를 분리합니다. RNA 회수는 이소프로판올 침전을 통해 이루어집니다. 이 침전은 산성 환경을 조성하여 RNA가 혼합물의 상단에 남게 됩니다.
염화세슘/브롬화에티듐 구배 원심분리
염화세슘/브롬화에티듐 농도구배 원심분리는 1950년대부터 연구실에서 사용되어 왔습니다. 이 방법은 세슘 이온과 물의 밀도 차이와 에티듐 브롬화물의 삽입을 이용하여 DNA 복제, 전사, 복구 및 재조합을 방해합니다.
이 기울기 원심분리는 다른 분리 프로토콜에 비해 복잡하고 비용이 많이 들며 시간이 많이 소요되는 방법입니다. 또한, 많은 양의 시료가 필요하기 때문에 모든 유형의 시퀀싱에 적합하지 않습니다. 또한, 에티듐브로마이드는 유해합니다. 따라서 이 방법은 한계로 인해 임상 검사실에서는 사용되지 않습니다.
고상 추출
고상 핵산 정제는 현재 시중에 판매되는 대부분의 상업용 추출 키트에서 찾아볼 수 있습니다. 일반적으로 원심분리기를 사용하는 스핀 컬럼을 사용하여 DNA를 빠르고 효율적으로 정제합니다. 먼저 컬럼을 시료 흡수에 적합하도록 조정해야 하는데, 이는 특정 pH의 완충액을 사용하여 수행할 수 있습니다. 세포가 파쇄된 후, 결합 용액의 pH 때문에 원하는 핵산이 컬럼에 흡수됩니다. 그런 다음 경쟁적 세척제로 세척하여 오염 물질을 제거하고, 물을 주입하여 원하는 핵산을 컬럼에서 분리합니다.
자기 비드 기반 정제
자기 분리는 현재 핵산 정제에 사용되는 간단하고 효율적인 방법으로 여겨집니다. 이는 고체상 추출법의 변형입니다. 비드는 표면이 음전하를 띠고 있으며 DNA와 같은 단백질에 선택적으로 결합합니다. 결합 과정은 튜브 측면에 자석을 대면 입자들이 벽 근처에 응집되기 때문에 보조적으로 수행될 수 있습니다. 세포 파편과 원치 않는 물질로 구성된 나머지 샘플은 버려질 수 있습니다. 핵산은 완충액을 사용하여 자기 입자에서 제거되고, 남아 있는 오염 물질은 세척됩니다.
자기 비드 기반 정제 프로토콜을 보여주는 다이어그램. 이미지 출처: Andrew Gane, 2019
이 방법은 분명 장점이 있습니다. 반복적인 원심분리, 진공 여과 또는 컬럼 분리가 필요하지 않아 시간과 비용 측면에서 효율적입니다. 시중에는 다양한 키트가 판매되고 있으며, 일부 제조업체는 자성 비드를 실리카를 포함한 다른 고상 추출 기술과 결합하기도 합니다. 이러한 기술은 소량의 시료만으로도 DNA 회수율을 높여 과학자들에게 도움을 주고 있습니다.
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